استفاده از پپتید نشانه و پروپپتید پروترومبین خوکی به منظور افزایش کارایی بیان، ترشح و فعالیت زیستی فاکتور 9 انسانی در رده سلولی hek293

فاکتور 9 انسانی، نقش محوری در مسیر انعقاد خون ایفا می کند و متحمل چندین نوع تغییر پس از ترجمه می گردد، که در میان آنها گاماکربوکسیلاسیون برای فعالیت فاکتور 9 ضروری است. گزارشات قبلی نشان دادند که تعویض پروپپتید در پروتئین های وابسته به ویتامین k با پروپپتید پروترومبین انسانی که گرایش کمی به آنزیم گاماکربوکسیلاز دارد سبب افزایش گاماکربوکسیلاسیون در رده سلولی hek293 شد. این احتمال وجود دارد که پروپپتید که بلافاصله پس از پپتید نشانه است، تاثیر زیادی در ترشح پروتئین نیز داشته باشد. در این مطالعه، با هدف بهبود کارایی گاماکربوکسیلاسیون و ترشح فاکتور 9 نوترکیب، جایگزینی توالی پری پروی فاکتور 9 انسانی با توالی های پری پروی دو پروترومبین پستاندار در نظر گرفته شد. مقایسه اولیه پروترومبین های چندین پستاندار نشاندهنده شباهت زیاد بین پروترومبین انسانی و خوکی بود. همچنین، مطالعات رایانه ای کارایی ترشح بالاتری را برای پپتیدهای نشانه مشتق از پروترومبین در مقایسه با پپتید نشانه بومی فاکتور 9 پیشگویی کرد. بنابراین، پس از جایگزینی پری پروپپتید فاکتور 9 با پری پروپپتید پروترومبین های انسانی و خوکی، عملکرد آنها بر بیان فاکتور 9 در حالت های گذرا و پایدار در رده سلولی hek293 بررسی شد. ارزیابی بیان پروتئین در حالت گذرا نشان داد که بیشترین و کمترین میزان کارایی ترشح بترتیب متعلق به پپتیدهای نشانه پروترومبین خوکی(91%) و بومی فاکتور 9(86%) است. نتایج حاصل از فعالیت انعقادی فاکتور 9 بیان شده توسط دو سازه مجهز به پروترومبین های خوکی(mu/ml180) و انسانی(mu/ml160) افزایش 10 و 9 برابری را بترتیب نسبت به سازه بومی فاکتور 9(mu/ml 18) نشان دادند. بررسی های کمی در سطح رونویسی نیز نشان دهنده افزایش معنی دار دو سازه هترولوگ بود که نتایج حاصل از بررسی ساختار ثانویه mrna با محاسبه کمترین مقدار انرژی آزاد موید آن بود. پس از انجام ترانسفکشن در حالت پایدار، مقدار فاکتور 9 بیان شده توسط کلون pprot-hfix افزایش معنی داری نسبت به دو سازه دیگر نشان داد(ng/ml/106 cell2000). علاوه بر افزایش بیان، سازه pprot-hfix کارایی ترشح بالاتری(98%) نیز نشان داد که با نتایج حاصل از بیان گذرا مطابقت داشت. پس از آن، محیط های جمع آوری شده از کشت های پایدار سه گانه برای جداسازی پروتئین فاکتور 9 با روش کروماتوگرافی تبادل یونی تخلیص شدند.